寡核苷酸在肿瘤治疗中的应用研究进展

寡核苷酸是由几个到十几个核苷酸聚合而成的物质，随着分子生物学及核酸人工合成技术的迅猛发展，通过寡核苷酸干扰遗传信息的传递，已经在肿瘤、病毒感染和遗传性疾病的治疗研究中取得一定的成果。本文就近年来寡核苷酸在肿瘤治疗方面的研究应用做一概述。

1  寡核苷酸的类型^[1]

根据作用方式不同，寡核苷酸可分为三种类型：①反义寡核苷酸，是按照Watson-Crick碱基配对原则，与互补的mRNA和mRNA前体结合的一类寡核苷酸, 可调控基因的转译；②三股螺旋寡核苷酸，是按照Hoog-steen碱基配对原则，与双链DNA的多聚嘌呤-多聚嘧啶区结合形成三链结构的一类寡核苷酸，能抑制基因的转录；③配合体，是指能与已知蛋白（如DNA结合蛋白、反式激活因子等），甚至未知蛋白结合的一类寡核苷酸, 在基因表达过程中起调节作用。其中，反义寡核苷酸是目前该领域研究中最为普遍的一类，故一般所讲的寡核苷酸泛指反义寡核苷酸。

2  寡核苷酸与肿瘤^[2]

内源性反义核酸在一定程度上参与了肿瘤的发生发展过程。Celano等^[3]发现结肠癌细胞COLO320 在缺乏多胺的条件下，细胞内诱导产生一种反义RNA，使其原癌基因c-myc的转录录水平明显下降。该反义RNA的转录水平与c-myc 的转录水平成负相关，还发现该反义RNA 中的长120个碱基的序列与c-myc、P53、胸苷激酶的反义链都有高度的同源性，推测该反义RNA对这些基因也有调节作用。Baccarini 等^[4] 在Wilms 瘤中发现编码胰岛素样生长因子2( IGF-Ⅱ) 基因的反义RNA，它存在的可能是Wilms 瘤中有高表达的IGF-2 mRNA 而缺少IGF-Ⅱ的多肽的原因。以上研究结果在一定程度上反映了反义核酸与肿瘤的关系。

3  寡核苷酸的在抗肿瘤方面的应用

3.1 食管癌

食管癌是一种常见的恶性消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌, 我国占半数以上，是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家。食管癌的发病涉及多种因素，各因素可因地理、风俗、生活行为习惯等差别所致其暴露机会、剂量摄入的差异而发挥不同的作用，各地区的主要流行因素可能不同。目前食管癌传统的治疗方法主要采用手术或放疗为主、化疗为辅的治疗模式，对晚期患者则采用放化疗配合姑息治疗。随着分子遗传学、细胞遗传学的发展，许多学者从基因和染色体水平对食管癌的病因进行广泛深入的研究，国内外在食管癌分子靶向治疗方面也取得了一些进展。

刘爱华^[5]等探讨人端粒酶反义寡核苷酸(PS-ASODN)对食管癌Eca-109端粒酶活性及细胞凋亡的影响。采用1-5uM的PS-ASODN、5uM的N-ASODN作用于Eca-109细胞后，在倒置显微镜下连续观察Eca-109细胞形态学改变；采用半定量TRAP-银染法检测端粒酶活性；用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期变化。实验结果发现：PS-ASODN对Eca-109细胞具有生长抑制作用，PS-ASODN作用后，细胞的生长速度缓慢,细胞体积缩小，部分细胞变形漂起。随着药物浓度增加，PS-ASODN对Eca-109细胞端粒酶活性的抑制作用逐渐增强，呈浓度依赖性和序列特异性。流式细胞仪检测到凋亡峰并受阻于G0/G1期，而对照组寡核苷酸无上述作用。可见，PS-ASODN不但抑制食管癌的增殖，降低端粒酶的活性，而且具有促凋亡的作用。

3.2 肝癌

肝癌为世界第六大常见恶性肿瘤，据世界卫生组织2002年数据显示，全球每年新增约63万例，死亡人数约60万人，为癌症第三号杀手。我国年发病人数约35万，每年约有32万人死于此病，发病率和死亡率均占癌症中的第二位，世界各地肝癌发病率有上升趋势。肝癌多发于青壮年，男性多于女性，病程短，进展快，复发率高，严重危害人们的健康和生命。研究表明，大多数肝癌是在乙肝的基础上，由多种危险因素如乙肝病毒（HBV）感染、摄入黄曲霉毒素（AFT）污染的粮食、饮酒等协同作用下导致肝硬化的发生，最后演变成为肝癌。肝癌基因治疗发展至今已有30余年，基因治疗的策略、载体和治疗基因随着科学的发展不断更新。近年来由于基础研究的重要突破，肝癌基因治疗逐步由基础研究走向临床治疗，并在临床实践过程中不断积累经验，不断成熟。

王季堃^[6]等考察了反义胰岛素样生长因子-I（IGF-I）寡核苷酸转染抑制人肝癌细胞生长，IGF-I是一种多效的生长因子，在肿瘤的生长、分化和转移过程中起重要作用。肿瘤细胞通过自分泌方式过度产生IGF-I，激活IGF-I受体，使自身不断生长，因此IGF-I成为反义核酸治疗的良好靶分子。利用反义寡核苷酸(ASON)技术人工合成IGF-I寡核苷酸片段，脂质体包裹并转染人肝癌细胞系BEL-7402细胞，可以抑制肿瘤细胞。

邓志华^[7]等研究了端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验，他们以人肝癌细胞株SMMC-7721、正常肝细胞株L-02为研究对象，采用TRAP-ELISA法对肿瘤细胞端粒酶活性进行定性定量分析；细胞形态学、TUNEL染色、DNA琼脂糖凝胶电泳观察端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用，用流式细胞仪对细胞周期进行时相分析，Western杂交对细胞周期蛋白进行研究。结果发现一定浓度的端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性，肝癌细胞端粒酶活性被抑制后传代23-26次出现细胞凋亡。实验结果表明端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性并诱导其凋亡。

3.3  胃癌

胃癌是我国最常见的消化道肿瘤，占恶性肿瘤死亡率的第一位。全国平均年死亡率为16/10万，高发区达60/10万。在国外，胃癌死亡率在不同人种、不同地区和同一地区不同时期有显著性差异，发病率较高的地区是日本，南非和东欧等，我国也是胃癌高发区之一。根据统计数据显示，世界范围内胃癌的发病率有不同程度的降低，但它仍是因癌症而死亡的第二大原因。饮食因素是胃癌的主要因素，特别是通过不良饮食习惯和方式摄入某些致癌物质。胃癌的传统治疗措施效果不理想，近来随着分子生物学及基因工程技术的发展，基因治疗作为肿瘤治疗的新方法逐渐受到人们的重视，胃癌基因治疗研究主要包括以下几个方面：抑癌基因的替代治疗、反义基因治疗、“自杀”基因治疗、免疫基因治疗等。

倪志强^[8]等以人胃癌细胞株MGC803为研究对象，应用ASODN技术,将MMP-9ASODN转染到MGC803细胞中，利用MTT法检测不同浓度不同时间MMP-9反义寡核苷酸对MGC803细胞的杀伤活性,流式细胞仪检测分析MMP-9反义寡核苷酸对MGC803细胞周期及凋亡的影响。结果MMP-9反义寡核苷酸在体外能够抑制MGC803肿瘤细胞增殖，且这种增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性；MMP-9反义寡核苷酸在体外能够诱导MGC803肿瘤细胞凋亡，作用与浓度和时间有关。结论MMP-9反义寡核苷酸可望成为一种人胃癌临床有效的治疗方法。

3.4  胰腺癌

根据世界卫生组织公布的统计资料，2002年全球胰腺癌新发病例232306例，其中男性124841例，女性107465例，占全部恶性肿瘤新发病例的2.1%，居第13位。胰腺癌是一个恶性度极高的肿瘤，其病死率接近100%。胰腺癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。吸烟是目前唯一获得公认的胰腺癌的病因，而大约35%的胰腺癌可归因于饮食因素，目前认为高热量摄入、高饱和脂肪酸、高胆固醇食品、富含亚硝胺的食品与胰腺癌发病率的增加有关,而饮食纤维、维生素C及水果、蔬菜等为胰腺癌的保护因素，而关于胰腺癌的遗传因素，除多个与胚系突变有关的遗传性综合征与胰腺癌风险增加有关外,编码药物代谢酶、DNA修复以及叶酸代谢相关基因多态性的存在可能与胰腺癌发生风险改变有关，而基因和环境之间的交互作用也可能改变胰腺癌的发生风险。胰腺癌早期诊断困难，手术切除率低，预后差，85%的患者在诊断后12个月内死亡，所以积极寻找治疗胰腺癌的新方法成为当务之急。近年来随着分子生物学的进步，人们对肿瘤发生、发展机制的认识有了长足的进步，为胰腺癌的治疗开辟新途径提供了广阔的前景。目前常用的方法有反义基因治疗、抗血管形成基因治疗、受体基因治疗、RNA干扰技术等。

潘耀振^[9]等将人胰腺癌细胞系PC-3经不同剂量⁶⁰Co照射后，绘制剂量存活曲线，选择照射剂量。用噻唑蓝（MTT）比色法比较脂质体介导的ASON（lipo-ASON）直接转染与联合照射转染对PC-3细胞的抑制效果，用流式细胞术和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测两种转染方法对PC-3细胞凋亡率及IGF-1R mRNA表达的影响。裸鼠种植PC-3细胞，肿瘤直径为5mm时，比较不同条件下（肿瘤局部照射与不照射）瘤内注射IGF-1R lipo-ASON对肿瘤的抑制情况。实验结果Lipo-ASON联合照射对胰腺癌细胞的抑制率（86.3％）、凋亡率（53.06％）及IGF-1R mRNA水平降低程度（降低79.2％）均明显高于未照射组（51.1％、20.25％和45.6％），差异有显著性。照射后瘤内注射lipo-ASON组的肿瘤体积明显小于其他各组，空白对照组与联合照射的lipo-ASON组、Lipo-ASON组肿瘤体积差异有显著性（P＜0.01）。结论针对IGF-1R的ASON能有效抑制肿瘤生长，当与辐射联合时，可显著提高抗瘤效果。

3.5  喉癌

喉癌是耳鼻喉科常见恶性肿瘤，发病率有日益增多的趋势。喉癌的发病率占耳鼻喉恶性肿瘤的11％-22％，居第三位，占全身恶性肿瘤的5.7％-7.6％，男性较女性多见。病因尚未明确，但与长期吸烟、饮酒、空气污染、病毒感染等多种因素综合作用有关。早期症状轻微，晚期出现严重声嘶、疼痛、吞咽困难、咳嗽、咳血、喉阻塞等症状。在细胞癌变的过程中，细胞周期中的多种调节因子参与细胞的癌变。癌基因的激活和抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础。研究证实肿瘤的发生发展与多种基因之间密切相关，通过改变或修饰相关基因及其表达产物的方式治疗肿瘤已成为肿瘤生物治疗中最引人注目的研究领域。

项丞^[10]等考察了生存素反义脱氧核苷酸（ASODN）诱导人喉癌细胞系Hep2凋亡的作用及对喉癌动物模型抑瘤率的影响。用脂质体LipofectamineTM 2000将反义寡核苷酸生存素片段导人人喉癌细胞系Hep2，通过测定细胞增殖的四甲基偶氮唑蓝法检测转染后72h内的细胞生长情况；转染48h后逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测生存素基因表达，WesternBlot检测蛋白表达；同时细胞凋亡原位检测（TUNEL）法和流式细胞仪检测细胞凋亡情况。Hep2细胞接种于32只裸鼠，分组给予Lipo-ASODN进行治疗，2周后评价其抑瘤率。结果MTT实验显示Lipo-ASODN组浓度为1.0μmol/L和2.0μmol/L时细胞生长曲线逐渐降低，72h细胞抑制率可达52.5％和71.4％，两组间差异具有统计学意义（P＜0.05），均显著高于对照组（P＜0.01）；转染48h后Lipo-ASODN组RT-PCR结果均可见生存素基因表达量明显少于对照组，Western Blot见生存素蛋白表达呈下降趋势；Lipo-ASODN组TUNEL检测可见细胞核内出现凋亡特征性阳性染色，流式细胞仪检测可见明显凋亡峰，而对照组无此现象。动物实验Lipo-ASODN组肿瘤抑制率可达48.1％和61.3％，显著高于对照组（P＜0.01），且两组间差异具有统计学意义（P＜0.05），呈一定的剂量依赖性。生存素反义寡核苷酸具有诱导喉癌细胞凋亡和体内抗肿瘤的作用，提示反义核酸技术可作为一种治疗手段应用于喉癌的基因治疗。

3.6    肺癌

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是当前世界上对人类生存和健康构成极大威胁的恶性肿瘤之一。半个世纪以来，世界各国肺癌的发病率和死亡率都有明显增高的趋势。估计到2030年，全球将有830万人死于吸烟相关的疾病，其中肺癌占3.1%。肺癌死亡居癌症死因的首位，致癌机制复杂而多样化。肺癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗等，选择性的阻断导致肿瘤细胞无限制增殖的信号转导通路、修正或封闭某个（些）致病性基因或基因位点、激发并增强人体自身免疫抗瘤能力已成为抗肿瘤新药研发的趋势。

孙杰^[11]等取肺癌细胞悬液建立小鼠肺癌动物模型后，选择40只随机分成4组，分别为空白对照组、实验对照组、VEGF反义寡核苷酸（ASODN）治疗组和VEGF正义寡核苷酸（SODN）治疗组。治疗结束后行大体、HE染色观察，并观察小鼠营养状况和症状。结果：对照组、VEGF反义寡核苷酸治疗组和VEGF正义寡核苷酸治疗组平均瘤质量分别为（7.14±1.68）、（4.26±1.37）和（7.33±1.56）g，VEGF反义寡核苷酸治疗组、VEGF正义寡核苷酸治疗组抑瘤率分别为58.2％和7.4％，ASODN组与对照组及SODN组比较差异有统计学意义，χ²分别为8.21和8.04，P值＜0.01。结论：阳离子脂质体介导反义VEGF寡核苷酸对小鼠肺癌的生长具有显著抑制作用，未发现明显的毒副反应，阳离子脂质体介导的基因转染技术有望成为治疗癌症的新方法。

3.7  白血病

白血病是血液系统最主要的恶性肿瘤之一，估计我国白血病的发病率每年2.71/10万，每年死于白血病患者近4万人，5年无病生存率仅达20%左右。RNA干扰（RNAi）是一种特异有效的阻断靶基因表达的新技术，广泛应用于白血病相关基因功能研究以及白血病基因治疗实验研究中。

孙玲^[12]等观察血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸对白血病细胞系K562细胞凋亡的作用。实验分为VEGF反义组、VEGF错义组和空白对照组，应用阳离子聚合物介导硫代修饰VEGF寡核苷酸转染体外培养的白血病细胞系K562细胞48h后，观察细胞形态，琼脂糖凝胶电泳法检测DNA梯状带，流式细胞仪Annexin VFITC／PI检测细胞凋亡。实验结果发现：反义组可见细胞集落减少，细胞皱缩，细胞质中颗粒增多，核固缩并出现细胞碎片；而错义组和空白对照组细胞均悬浮成团，细胞轮廓清楚，胞体透亮，生长旺盛。反义组见凋亡梯形带，错义组和空白对照组仅1条DNA条带。反义组细胞凋亡率达23.28％，与错义组和空白对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：VEGF反义寡核苷酸可诱导白血病细胞凋亡．提示VEGF与抗白血病细胞，凋亡有关。

根据已有相关报道，寡核苷酸在肿瘤治疗中的应用研究主要集中在几个方面^[2]：

癌基因的反义封闭，癌基因的激活是肿瘤发生的重要原因之一, 阻断癌基因的表达是治疗肿瘤的有效途径, 反义核酸技术为此提供了有利条件。目前已发现的100 多种与肿瘤相关的癌基因均已被当作特异性的反义核酸治疗的靶点。

肿瘤自分泌生长因子的反义阻断，研究表明, 可利用反义核酸抑制某些与肿瘤恶性表型有关的自分泌生长因子及其相关受体, 从而阻断肿瘤的恶性生物学行为, 以达到治疗目的。

激发机体免疫应答的反义免疫基因治疗，针对肿瘤细胞逃避机体免疫监视的不同机制, 可通过反义核酸的阻断来增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。

抑制肿瘤细胞耐药性, 提高化疗效果，肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉抗药性是造成肿瘤化疗治疗失败的主要原因, 在基因治疗中可用反义核酸来封闭多药耐药基因MDR1的高表达, 从而提高化疗的效果。

4 展望

寡核苷酸在应用上仍有许多问题还亟需解决。首先，反义核酸一般只能特异性地抑制某一基因，但细胞的癌变并非仅由某一基因病变所导致，而是数个基因共同作用的结果；其次，针对靶RNA 的哪一片段设计AS-ODN 才能进行有效的阻断目前还较难把握。另外，AS-ODN 在体内易被降解，细胞摄取的效率不高等等，都阻碍了反义核酸在肿瘤治疗中的应用。但利用反义核酸的基因治疗有着极为显著的优点，它的靶基因范围广，整合入细胞的病毒基因、仅知道部分序列的基因都可以用反义核酸进行封闭，而且安全性高，反义核酸只作用于特异的mRNA而不改变所调节基因的结构，最终还会被RNase 完全水解，不会有残留，即使在治疗过程中出现未预料到的副作用，也可以通过停药来终止副作用。此外，反义核酸还有操作简单，特异性强等优点。反义核酸作为一种治疗药物应用于临床，预示着一个遗传药理学新时代的开始，成为目前最有可能大规模应用于临床的基因疗法。